该切磋通过生物音讯学本事和细胞实习确定了LUM基因过外达对肝癌发作兴盛的强迫感化，揭示了LUM举动一种新的生物象征物，且预测预后和免疫反映的潜力。

　　肝细胞癌(HCC)是天下上最常睹的癌症之一。基于免疫查验点强迫剂的疗法是目前正正在切磋的一种晚期HCC的全身诊疗计划。肿瘤突变负荷(TMB)是指每百万碱基中检测到的体细胞基因编码过失、碱基插入、交换或缺失的总数，被以为与免疫诊疗成效相合。的确来说，TMB越高，患者从免疫诊疗中获取的临床获益就越好。然而，针对HCC中TMB合连基因的切磋较少。因而，确定合连的可预测生物象征物，并认识它们怎样影响疾病转机和诊疗至合紧要。

　　Lumican(LUM)是编码富含亮氨酸的小卵白众糖家族II类成员的基因，合键正在结缔结构中外达。据报道，LUM与众种恶性肿瘤相合，搜罗乳腺癌、肺癌和胃癌，这讲明它能够是一种潜正在的癌症生物象征物。先前的切磋一经证据了LUM正在肝纤维化和非酒精性脂肪性肝病中的成效，但目前尚不大白LUM是否与HCC合连。

　　因而，正在这项切磋中，作家采用了癌症基因组图谱(TCGA)数据库中的HCC合连数据，正在其TMB合连的区别外达基因(DEGs)膺选择LUM举动靶基因，研究其正在HCC中的临床和免疫诊疗特质以及潜正在的机制，并通过实习确定了LUM正在HCC中的合连成效。图1先容了该切磋的团体步伐和思绪。

　　图1 本职业流程图，分为三个部门：(1)基因筛选、(2)单基因明白、(3)实习

　　切磋者从TCGA数据库中获取肝癌数据并阴谋TMB后，按照TMB中位数将样天职为两组；随后运用WGCNA修建基因共外达搜集，将具有类似外达形式的基因导入统一模块，变成分层聚类树，此中每种颜色代外一个模块(图2a)。

　　此中，赤色模块正在崎岖TMB组之间的区别最为明显(r=0.18, p=0.00056)(图2b)，对赤色模块实行基因本体(GO)明白，呈现基因合键富集于细胞外基质(ECM)结构和胶原集合通途(图2c)。京都基因与基因组百科全书(KEGG)明白显示，基因合键富集于局灶黏附、ECM受体互相感化和PI3K-Akt信号通途(图2d)。

　　图2 a WGCNA模块示希图。动态树切分吐露初始模块。模块颜色代外最终模块。等第树中的每个分支或每条笔直线代外一个基因。b WGCNA模块性状合连图。每行代外一个模块。每一列吐露一个属性。蓝色吐露负合连，赤色吐露正合连。c 赤色WGCNA模块中的GO基因富集明白：生物进程(BP)、细胞因素(CC)和分子成效(MF)。d 赤色WGCNA模块基因的KEGG富集明白

　　正在区别明白中，该切磋将低TMB组设为比较组，判决出了105个区别基因；随后利用Venn图确定了赤色模块和DEGs之间重迭的合键基因，搜罗MYL9、AEBP1、CCL21和LUM(图3a)，并最终拔取LUM举动靶基因。

　　切磋者明白了TCGA肝癌数据集样本的RNA-Seq谱，呈现肿瘤结构中LUM的外达和卵白程度均彰彰低于寻常结构，性别和年纪区别不明显(图3b-e)。人类卵白质图谱(HPA)和临床样本的免疫组化也外明了这一结果(图3f-h)。

　　图3 a 来自WGCNA赤色模块和DEGs的合键基因的Venn图。b 正在LIHC和寻常样本中LUM基因的外达程度。c 正在LIHC和寻常样品中LUM卵白的外达程度。d-e LUM卵白外达与临床特质的干系。f HPA数据库中寻常结构和肝癌结构中LUM的免疫组化结果。g 临床HCC及相近标本的免疫组化结果，从上至下分辨以100倍、200倍、400倍和800倍的增量放大。h 临床HCC及相近标本中LUM卵白的相对外达程度。i PCR检测LX-2、SNU398、SNU182、HepG2和Hep3B细胞中LUM的外达程度。j-k WB检测LX-2、SNU398、SNU182、HepG2和Hep3B细胞中LUM卵白的外达程度

　　LUM与患者活命和预后合连明白讲明，与白人比拟，亚洲人LUM的团体外达程度较低 (图4a)，高LUM组亚洲患者的疾病特异性活命期DSS和无疾病间隔PFI两者预后较好(图4b)。其余，针对全豹患者的诊断性ROC弧线显示出LUM潜正在的预测本事(弧线c)。随后，切磋者通过最小p值法确定了LUM是HCC患者PFI的一个目标(截止值=0.8,p=0.028)(图4d)。单要素和众要素Cox回归明白进一步外明了这一点(图4e-f)。

　　该切磋利用TIMER2.0软件对LUM与HCC合连基因TP53、KRAS、PTEN和CCND1实行合连性明白，呈现外达趋向类似(图4g)。与野生型TP53或CTNNB1患者比拟，突变TP53或CTNNB1患者的LUM外达较低(图4h)。LUM的外达与B细胞、中性粒细胞和骨髓树突状细胞的浸润程度呈正合连(图4i)。

　　图4 a 亚洲人的LUM转录程度低于白人。b LUM高外达组的亚洲患者DSS和PFI预后较好。c 全豹患者的诊断性ROC弧线。d LUM组LIHC患者PFI的K-M图，p值最小法(p=0.028)。e-f LIHC患者的单要素和众要素PFI明白。g LUM外达与TP53、KRAS、PTEN、CCND1外达呈正合连。h LUM正在TP53或CTNNB1突变的患者中外达下调。i应用MCP-Counter对LUM与B细胞、中性粒细胞、髓树突状细胞免疫浸润程度的偏合连明白。

　　正在GO明白中，高LUM组基因正在ECM结构和胶原集合合连通途富集(图5a)。按照KEGG明白，这些基因合键属于PI3K-Akt信号通途、局灶黏拥护ECM受体互相感化合连通途(图5b)。基因集富集明白显示，与细胞黏拥护ECM合连的众个基因组，以及凋亡和肿瘤通途均正在高LUM组中富集 (图5c-f)。

　　为了进一步切磋LUM的成效，该切磋拔取了两种肝癌细胞系SNU398和Hep3B，并通过载体正在这些细胞中过外达LUM。PCR外明转染细胞中存正在LUM，而Western blotting显示与比较组比拟，LUM的外达弥补(图6a-b)；免疫荧光染色显示了LUM正在细胞中的定位(图6c)，这些转染的细胞被界说为LUM组。CCK-8实习显示，与寻常SNU398和Hep3B细胞比拟，LUM组的吸光度较低，细胞增殖删除(图6d-e)，96小时后，转染LUM的细胞发展速率变慢(图6f)。

　　正在平板克隆变成实习中，LUM组克隆的巨细和数目受到强迫。细胞增殖染色中，LUM过外达组edu阳性细胞率低落，讲明细胞增殖删除，LUM过外达强迫细胞增殖(图7)，这些区别正在两种癌细胞系中都是明显且类似的。

　　图7 a 正在平板克隆变成实习中，LUM过外达组克隆的巨细和数目受到强迫。b LUM过外达组edu阳性细胞数目删除

　　该切磋采用Annexin V-FITC/PI染色法考查LUM过外达是否诱导凋亡。与比较组比拟，转染LUM的SNU398细胞的凋亡率更高，早期凋亡(从~20.8%弥补到~51.8%)和晚期凋亡(从~16.8%弥补到~18.4%)均有所弥补(图8a)。其余，正在Hep3B细胞中考查到同样的趋向(早期凋亡从~0.57%弥补到~29.0%，晚期凋亡从~0.57%弥补到~7.58%，图8b)，毁伤后0和24小时对SNU398和Hep3B细胞的划痕实习图像如图8c-d所示。与未管制的细胞比拟，过外达LUM的细胞迁徙和伤口愈合删除。Transwell实习显示，过外达LUM可阻拦SNU398和Hep2B细胞的迁徙(图8e-f)，还可削弱这些细胞的迁徙活性(图8g-h)。因而，该文切磋者以为LUM可能强迫肝癌细胞的迁徙和侵袭。

　　该切磋讲明，LUM的外达与肝癌的兴盛相合：LUM正在HCC中低外达；它是PFI的一个目标基因研究，与很众与HCC成效合连的紧要基因相合。其余，LUM还具有免疫浸润感化；与LUM合连的厚实通途和实习验证联合支撑其列入HCC的发病机制。总的来说，这些呈现揭示了LUM举动一种新的生物象征物和预测预后和免疫反映的潜力。